周景文教授綜述：高通量篩選技術(shù)在工業(yè)生物技術(shù)的應(yīng)用米樂 M6

　　工業(yè)生物技術(shù)利用微生物來生產(chǎn)許多重要的產(chǎn)品，例如生物燃料、酶制劑、抗生素、生物材料和營養(yǎng)化學(xué)品等。為了快速高效地篩選出更適于工業(yè)化生產(chǎn)的微生物菌株，在自動化設(shè)備和快速測定方法不斷發(fā)展和完善的背景下，各種高通量篩選（high-throughput screening，HTS）策略應(yīng)運而生。

　　在最新發(fā)表于Cell Press細胞出版社旗下Trends in Biotechnology期刊的綜述“High-Throughput Screening Technology in Industrial Biotechnology”中，來自江南大學(xué)陳堅院士團隊的周景文教授課題組深入探討了提高HTS效率的重要因素，并總結(jié)了HTS在強化工業(yè)微生物性能方面的應(yīng)用，以及在合成生物學(xué)、納米技術(shù)和人工智能快速發(fā)展的背景下，工業(yè)生物技術(shù)中的HTS當前所面臨的挑戰(zhàn)和潛在的改進措施。

　　天然存在的微生物經(jīng)常存在產(chǎn)量低、對工業(yè)條件耐受性差等不足，因此很少被直接用于工業(yè)生產(chǎn)。研究人員目前已經(jīng)開發(fā)出各種策略來克服這些問題，包括通過在基因水平上改變微生物的生理功能、為菌株生長和產(chǎn)物積累提供最佳環(huán)境等。這些經(jīng)過改造后被用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物，通常被稱為細胞工廠。

　　研究人員通常采用隨機或定向誘變的方法來提高細胞工廠中目標產(chǎn)物的積累。由于有益突變的概率可能非常低，開發(fā)在大型突變體庫中快速篩選目標微生物菌株的方法就變得尤為重要。常規(guī)的篩選效率由于通量低、檢測慢、勞動強度高，導(dǎo)致篩選成本昂貴、效率低下。針對上述問題，高通量篩選（HTS）結(jié)合了自動化和微定量實驗以及大規(guī)模數(shù)據(jù)分析等先進手段，已被廣泛用于工業(yè)生物技術(shù)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。

　　誘變技術(shù)已廣泛應(yīng)用于培育工業(yè)微生物，目前仍被認為是產(chǎn)生優(yōu)良工業(yè)微生物的有效途徑。常用的物理和化學(xué)誘變方法包括紫外線、α射線、β射線、γ射線、X射線、使用烷化劑和堿類似物等。另外，一些新的誘變方法，如室溫常壓等離子體（ARTP）和重離子等技術(shù)也得到廣泛應(yīng)用，與傳統(tǒng)方法相比，這兩種方法具有突變率高、隨機突變位點多和不需要有毒有害化學(xué)品等優(yōu)勢。

　　ALE是基于微生物通過有益突變適應(yīng)環(huán)境條件的能力，常與代謝工程和合成生物學(xué)策略相結(jié)合，以構(gòu)建更高效的微生物細胞工廠。其典型的應(yīng)用包括（i）強化微生物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)性；（ii）提高菌株的生長速度、底物消耗或產(chǎn)物積累能力;（iii）激活合成非天然產(chǎn)物或消耗非天然底物的潛在途徑。eVOLVER、微滴微生物培養(yǎng)（MMC）系統(tǒng)等已被設(shè)計用于微生物高通量培養(yǎng)和適應(yīng)性進化。另外，基于ALE的原理，基因組復(fù)制工程輔助的連續(xù)進化（GREACE）系統(tǒng)也被開發(fā)用于強化菌株的性能（圖2B）。

　　定向進化是改造酶的有效方法，已被廣泛用于工業(yè)生物合成過程。根據(jù)構(gòu)建突變庫的方法，定向進化可分為非理性設(shè)計、理性設(shè)計以及半理性設(shè)計。非理性設(shè)計是一種不需要深入了解酶的序列和結(jié)構(gòu)隨機進化策略，主要包括易錯PCR、DNA改組和飽和突變等（圖2C）。理性設(shè)計是一種基于智能計算策略的改造方法，用于模擬天然酶的動力學(xué)和進化，通過這種方法可以更有效地篩選目標突變體。半理性設(shè)計是將非理性設(shè)計與理性設(shè)計相結(jié)合而形成的，是目前應(yīng)用最為廣泛的一條路徑。

　　為了以更合理的方式構(gòu)建菌株庫,研究人員已經(jīng)建立了許多基于隨機組裝的策略，如啟動子-5-UTR復(fù)合物與基因的隨機組裝、多重自動化基因組工程（MAGE）、ePathBrick、CasEMBLR以及COMPASS等（圖2D）。這些隨機組裝策略有助于構(gòu)建具有多種不同功能和調(diào)節(jié)單元的大型文庫。

　　高通量篩選的實現(xiàn)通?；诰珳实母咄繖z測設(shè)備。酶標儀是HTS中最常用的設(shè)備，多功能酶標儀也已被廣泛應(yīng)用于細胞生長或凋亡、代謝物含量、酶活性等的檢測。此外，研究人員還開發(fā)了基于拉曼光譜等特殊光譜等來檢測更多化學(xué)物質(zhì)的設(shè)備，其中一些設(shè)備可以與流式熒光激活細胞分選（FACS）、微流控和光鑷技術(shù)等協(xié)同應(yīng)用，進一步發(fā)展并用于高通量單細胞檢測、分析和分類。

　　自動化是HTS的一項重要特征，是進行微定量實驗和大規(guī)模分析的基礎(chǔ)。HTS集成了一系列連續(xù)的自動化實驗操作，經(jīng)典的HTS設(shè)備主要包括自動挑菌儀、移液工作站，以及多功能酶標儀等。此外，PCR儀、離心機、滅菌系統(tǒng)和包裝系統(tǒng)等一系列附屬設(shè)備也經(jīng)過相應(yīng)的改進，被集成到HTS系統(tǒng)中用于進一步提高篩選效率。

　　流式細胞術(shù)可以快速分析單個細胞的多個參數(shù)，如細胞密度和大小、內(nèi)部復(fù)雜度以及其他熒光信號，并以多種方式對目標群體進行快速分類，從而以高純度和高通量篩選目標細胞?；诹魇郊毎g(shù)的FACS技術(shù)已成為基礎(chǔ)生物學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用中必不可少的工具。

　　微流控技術(shù)是一種用于處理微升至皮升級液體的技術(shù)，其核心為被稱為“芯片實驗室”的微流控芯片?；谖⒘骺丶夹g(shù)，研究人員開發(fā)出了用于單細胞分析的微流控系統(tǒng)，其具有高靈敏度、定量讀出和準確性等優(yōu)點。

　　FACS一般被應(yīng)用于分析細胞內(nèi)熒光信號的或膜結(jié)合產(chǎn)物，而工業(yè)生物技術(shù)中的大多數(shù)目標產(chǎn)物是胞外產(chǎn)物，使得FACS應(yīng)用受到限制；而微流控技術(shù)的缺點是其篩選速度遠低于FACS。因此，結(jié)合了微流控和細胞分選的微流控流式分選技術(shù)(FADS)，打破了傳統(tǒng)FACS和微流控技術(shù)的局限性，以其有效的識別和分離方法而備受關(guān)注。

　　目前已經(jīng)建立了許多基于紫外光/可見光譜、特殊光譜、熒光信號等的篩選方法。紫外光/可見光譜及熒光信號檢測法可以分為直接法和間接法（圖4A、4B）。對于具有特殊分子結(jié)構(gòu)或顏色特性的產(chǎn)物，可通過直接測量吸光度進行篩選，而對于沒有直接吸光特性的產(chǎn)物可以通過加入pH指示劑、與金屬離子螯合、或與酶促或化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)間接來檢測。使用熒光染料或探針生成的熒光信號也已被廣泛應(yīng)用于篩選工業(yè)微生物，基于熒光的HTS還可以實現(xiàn)超高通量篩選（uHTS）。

　　基于拉曼光譜，傅里葉變換紅外（FTIR）和傅里葉變換近紅外（FTNIR）光譜等特殊光譜的策略也已在工業(yè)生物技術(shù)中得到應(yīng)用（圖4E）。這些方法具有快速、靈敏、無損、高通量和實時檢測等優(yōu)勢，并已經(jīng)被用于單細胞和生物催化劑的無標記篩選。

　　某些目標產(chǎn)物或關(guān)鍵中間產(chǎn)物不能被直接或間接的顏色或熒光反應(yīng)進行檢測，從而限制了高通量篩選技術(shù)的使用，而基于各類傳感器的篩選方法可以作為一種替代策略。目前，應(yīng)用較多的主要有生物傳感器（Biosensor）和電化學(xué)傳感器（Electrochemical Sensor，ES）。生物傳感器由傳感元件和報告元件組成。傳感元件識別特定的細胞內(nèi)代謝物，通過一系列基因回路后由報告元件生成定量信號，目前已開發(fā)出了基于蛋白質(zhì)和基于核酸的生物傳感器（圖4C）。電化學(xué)傳感器則是利用電極表面發(fā)生生化反應(yīng)而產(chǎn)生的電流變化進行檢測，具有對目標高度敏感、選擇性強、響應(yīng)快速等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品中有害成分分析和環(huán)境監(jiān)測，但目前涉及ES在工業(yè)生物技術(shù)中檢測特定發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用研究仍較少。

　　周景文，江南大學(xué)教授，教育部青年長江學(xué)者，國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者。2003年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)，2006年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士畢業(yè)，2009年在江南大學(xué)獲得工學(xué)博士學(xué)位。2009年加入江南大學(xué)生物工程學(xué)院。2012-2013年在哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系進行博士后研究。研究興趣包括合成生物學(xué)在植物天然產(chǎn)物合成和新資源食品中的應(yīng)用。近5年在Metab. Eng.、Green Chem.、Microbiol. Mol. Biol. Rev.、Trends Biotechnol.等發(fā)表論文30篇。曾先后獲得國家技術(shù)發(fā)明獎二等獎、中國專利金獎等科研獎勵。目前擔任江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心副主任，中國生物工程學(xué)會青年工作委員會副主任，《生物工程學(xué)報》、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology和Electronic Journal of Biotechnology編委。

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